Μετά την ανατροπή του τυράννου Δαμοτέλη, τη διακυβέρνηση της Σάμου ανέλαβαν οι μεγάλοι γαιοκτήμονες (γεώμοροι). Το 540 περίπου π.Χ. η Σάμος αναγκάστηκε να αναγνωρίσει την κυριαρχία του Κύρου. Τότε ίσως να κάηκε και το πρώτο Ηραίο. Ακολούθησε μία περίοδος αστάθειας μέχρι το 532 περίπου π.Χ., που ο Πολυκράτης έγινε τύραννος με τη σύμπραξη των δύο αδελφών του και την υποστήριξη των εμπόρων και των βιοτεχνών.

Μόλις έγινε τύραννος ο Πολυκράτης, σε μία προσπάθειά του να αποτρέψει πιθανές συνωμοσίες, εξόρισε ορισμένους αριστοκράτες. Ενίσχυσε το στρατό που, κατά τον Ηρόδοτο, περιελάμβανε χίλιους τοξότες και ναυπήγησε στόλο από εκατό πεντηκοντόρους. Σχεδίασε μάλιστα ένα νέο τύπο πλοίου τη Σάμαινα, μία διήρη με αμβλεία πλώρη. Με το στόλο του αυτό -που συχνά επιδίδετο και σε πειρατικές επιδρομές- κατέλαβε αρκετά νησιά και ορισμένες παραλιακές πόλεις. Συνέπηξε συμμαχία με τον Πεισίστρατο, τον τύραννο της Νάξου Λύγδαμι και το φαραώ της Αιγύπτου Άμασι που ευνόησε τους σαμίους εμπόρους της Ναυκράτιδος. Όταν όμως το 525 περίπου π.Χ. ο πέρσης βασιλιάς Καμβύσης επιτέθηκε στην Αίγυπτο, ο Πολυκράτης τού παρέσχε σαράντα πλοία σε μία προσπάθεια να επικυρώσει την εξουσία του. Τη διοίκηση των πλοίων αυτών ανέθεσε στους πολιτικούς του αντιπάλους, επειδή ήθελε να τους απομακρύνει από τη Σάμο. Αποτέλεσμα της πολιτικής του Πολυκράτη ήταν να γίνει η Σάμος σε διάστημα δέκα ετών η πρώτη ναυτική δύναμη στο Αιγαίο. Είναι χαρακτηριστικό ότι προϊόντα της σαμιακής βιοτεχνίας, με πιο χαρακτηριστικά τα ειδώλια, αποκαλύφτηκαν σε μεγάλες ποσότητες κατά την ανασκαφή των ιερών της Λίνδου και της Καμίρου στη Ρόδο, της Αμαθούντας στην Κύπρο και της Ναυκράτιδος στη Αίγυπτο. Από ορισμένους ιστορικούς μάλιστα υποστηρίχθηκε ότι οι πόλεις της Ρόδου ήταν υποτελείς του.

Ο Ηρόδοτος αναφέρθηκε με θαυμασμό στα οικοδομικά έργα που εκτελέστηκαν την περίοδο αυτή στη Σάμο, δηλαδή στο Ευπαλίνειο όρυγμα, στο μήκους δύο σταδίων μόλο του λιμανιού και στο δεύτερο Ηραίο. Δεν προσδιόρισε, όμως, αν οφειλόταν στον τύραννο η πρωτοβουλία για τα έργα αυτά. Στον Πολυκράτη, ωστόσο, απέδωσε την κατασκευή της τάφρου γύρω από τα τείχη της Σάμου, στην οποία εργάστηκαν λέσβιοι αιχμάλωτοι πολέμου. Εξάλλου, λέγεται ότι ο Πολυκράτης συγκέντρωσε και κατέγραψε τα ομηρικά έπη. Στην αυλή του φιλοξενούνταν πολλοί ποιητές και μεταξύ τους ο Ίβυκος από το Ρήγιο της κάτω Ιταλίας και ο Ανακρέων από την Τεώ.

Εντούτοις, η εξουσία του έληξε βίαια. Ο Πολυκράτης επιδιώκοντας να επεκτείνει την κυριαρχία του σε όλη την Ιωνία και τα νησιά πήγε στις Σάρδεις, όπου δολοφονήθηκε. Ο γραμματέας και τοποτηρητής του Πολυκράτη Μαιάνδριος προσπάθησε να εγκαθιδρύσει καθεστώς ισονομίας. Αναγκάστηκε, όμως, να παραχωρήσει την εξουσία στον αδελφό του Πολυκράτη Συλοσώντα, ο οποίος αποβιβάστηκε στη Σάμο με τη συνοδεία περσικής δύναμης.